ChroZen Amino Acid Analyzer — готовое решение для определения первичных и вторичных аминокислот.
Почему нужна дериватизация. Все аминокислоты, кроме триптофана, тирозина и фенилаланина, не имеют поглощения в ультрафиолетовой и видимой области и не флуоресцируют. Прямое детектирование невозможно — аминокислоту нужно превратить в производное, которое видит детектор. Применяются реагенты нингидрин, OPA (орто-фталевый альдегид), PITC (фенилизотиоцианат) и FMOC (флуоренилметоксикарбонилхлорид).
Реализованы обе схемы.
Послеколоночная дериватизация. Аминокислоты разделяются на катионообменной колонке, а реагент подаётся в реактор перед детектором. Метод нингидрина: реакция при 130 °C, первичные аминокислоты дают пурпурный продукт Руэманна с поглощением при 570 нм, вторичные — при 440 и 405 нм. Условия из каталога: высокоэффективная натриевая катионообменная колонка 4,0 × 150 мм, температура 42 °C, расход 0,4 мл/мин, градиент подвижных фаз 1700-0112 и Na740:RG011, детектор УФ на 570 нм, ввод 20 мкл; послеколоночная система Pinnacle PCX с реактором 0,5 мл, реагент TRIONE, расход реагента 0,3 мл/мин, реактор 130 °C при расходе 0,3 мл/мин. Определяются 19 соединений: аспарагиновая кислота, треонин, серин, глутаминовая кислота, пролин, глицин, аланин, цистин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, лизин, аммиак, гистидин, триптофан, аргинин.
Предколоночная дериватизация. Реагент OPA реагирует со свободной аминогруппой при комнатной температуре с образованием изоиндола, флуоресцирующего в ультрафиолете; регистрация возможна и флуоресцентным, и УФ-детектором. Условия из каталога: колонка C18 4,6 × 150 мм, зерно 5 мкм, температура 40 °C, расход 2,0 мл/мин, градиент — фаза A 40 мМ Na₂HPO₄ pH 7,8, фаза B ацетонитрил-метанол-вода 45:45:10, детектор УФ на 338 нм, ввод 20 мкл. Программа автосамплера: 20 мкл пробы, 30 мкл реагента A, перемешивание 35 мкл, 20 мкл реагента B, перемешивание 50 мкл. Определяются 17 соединений.
Пробоподготовка (пример из каталога для соевого соуса): навеска 200 мг в виалу, добавление 30 мл 6 н. соляной кислоты, гидролиз при 130 °C в течение 24 часов, разбавление 50 мл очищенной воды, отбор 1 мл и упаривание, растворение в 1 мл боратного буфера pH 2,2 (или 0,02 н. соляной кислоте), фильтрация через шприцевой фильтр 0,45 мкм.
Применение: науки о жизни (структура белка, оценка синтезированных пептидов); фармацевтика (растворы для инъекций, препараты для питания); пищевая промышленность и напитки (незаменимые аминокислоты); клиническая диагностика (уровни аминокислот и их дефициты).
